鐘振國(guó) 屈澤強(qiáng) 鮑運(yùn)平 王乃平 張鳳芬 張要艷

          (廣西中醫(yī)學(xué)院 廣西530001)

摘要:目的探討三七總皂(PNS)對(duì)老年性癡呆(AD)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙的改善作用。方法以D一半乳糖腹腔注射致亞急性損傷合并鵝膏草氨酸損毀雙側(cè)大腦Meynert基底核建立AD大鼠動(dòng)物模型;Mom。水迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)。結(jié)果PNS高、低劑量組大鼠在Morris水迷宮測(cè)試中，逃避潛伏期明顯縮短，尋求次數(shù)、原平臺(tái)象限比、跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加，與模型組比較有顯著意義(P<0.05)a結(jié)論PNS對(duì)AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害具有明顯改善作用。

關(guān)鍵詞:三七總皂;老年性癡呆;動(dòng)物模型;Morris水迷宮。水迷宮;學(xué)習(xí)與記憶;大鼠

中圈分類號(hào):8285. 5

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer' sdisease , AD )，是一種大腦神經(jīng)退行性疾病，65歲以上人群發(fā)病率約3%}5%，隨著世界人口逐年老化，其發(fā)病率也在不斷上升，但目前仍缺乏有效的防治藥物和方法。三七為五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng ( Burk )  F. H.Chen的根，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為其性味甘、微苦、溫，歸肝胃經(jīng)，具有化痕、止血、活血定痛之效，現(xiàn)代藥理研究表明，三七對(duì)心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有不同的藥理作用，而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損害的保護(hù)作用尤引人注目。三七的藥理活性成分的研究主要集中在三七皂貳成分和氨基酸。為此，我們應(yīng)用Morris水迷宮( Morris water maze,  MWM)評(píng)價(jià)T三七總皂苷( total saponins of Panax notoginseng, PNS)對(duì)由D一半乳糖(D-galactose , D-gal)致亞急性衰老加上鵝膏葷氨酸(ibotenic acid，IBA)損毀腦Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert, nbM)所致的AD大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用。

 

1實(shí)驗(yàn)材料

1. 1藥品和試劑

PNS:由云南玉溪維和制藥廠提供;石杉?jí)A甲( huperzin A , Hup一A):上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào):030202 ) ; D-gal:上海恒信化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(批號(hào):20020406 ) ; IBA ; Sigma ChemicalCo. P.0.產(chǎn)品(批號(hào):10k1285)。

1. 2實(shí)驗(yàn)器材

WDT一2型腦立體定位儀:西安西北光電儀器廠生產(chǎn);Morri。水迷宮設(shè)備全套(包括Morri。水迷宮，電腦攝像系統(tǒng)，配套軟件分析系統(tǒng)):北京中科院生理所生產(chǎn)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2. 1動(dòng)物分組、造模與給藥

健康Wistar大鼠90只，其中3月齡15只，為青年對(duì)照組(以下稱青年組)。15月齡75只，隨機(jī)抽取15只用作正常老年對(duì)照組(以下稱老年組)。其余60只大鼠作為造模鼠。大鼠均由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，造模用的60只大鼠腹腔注射0.96% D-gal，生理鹽水(NS)配制，按5 mL/kg體重給藥;青年組和老年組大鼠則腹腔注射等體積NS，每日1次，連續(xù)6周。從第7周開(kāi)始進(jìn)行腦內(nèi)雙側(cè)nbM核注射IBA。方法:大鼠以3%戊巴比妥鈉35 m歲kg體重腹腔麻醉，將大鼠固定于腦立體定位儀上，在前自后0. 8 mm，中線旁開(kāi)2. 6 mm,顱骨下8. 2 mm，每側(cè)緩慢注射IBA 1 uL ( NS配制，濃度5 g/L)[1]。青年組和老年組在相同腦區(qū)內(nèi)注射等體積NS.2周后，將造模組存活的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱模型組),PNS高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組),PNS低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)和石杉?jí)A甲陽(yáng)性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱石杉?jí)A甲組)。高劑量組以PNS灌胃，200 mg/kg體重給藥;低劑量組以PNS灌胃,100 m歲kg體重給藥;石杉?jí)A甲組以0. 3 m歲kgHup-A灌胃給藥;模型組、青年組和老年組以等體積NS灌胃。各組均每日給藥1次，連續(xù)4周，完成造模和治療。

2. 2大鼠學(xué)習(xí)與記憶行為測(cè)試

采用MWM測(cè)試法，進(jìn)行定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。MWM參照有關(guān)文獻(xiàn)制作[2]。迷宮置于房間的中央，為一圓形不銹鋼水池，直徑200 cm，高50 cm，水深30 cm。將水池等分為4個(gè)象限，在象限3中心放置一平臺(tái)，平臺(tái)為圓形，直徑11 cm，平臺(tái)高29 cm(即平臺(tái)低于水面1 cm，稱隱藏平臺(tái))。水迷宮正上方2m高處裝有一個(gè)小型攝像機(jī)，并與另一房間的錄像機(jī)和監(jiān)視器連接，記錄大鼠的游泳軌跡和游泳時(shí)間。

(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation ):共進(jìn)行5d，每天分上下午2個(gè)時(shí)間段，每一時(shí)間段每鼠訓(xùn)練4次。將大鼠面向池壁由4個(gè)人水點(diǎn)放人池中，測(cè)其60 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)(大鼠找到平臺(tái)并滯留其上5s為成功進(jìn)駐)所需時(shí)間(即逃避潛伏期，escapelatency )。如在60 s內(nèi)大鼠不能成功進(jìn)駐平臺(tái)，則實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并令其停留10s，記錄逃避潛伏期為60s，每次訓(xùn)練間隔時(shí)間為60s。

(2)空間探索試驗(yàn)( spacial probe test) ; MWM實(shí)驗(yàn)最后1d，撤除平臺(tái)，從原平臺(tái)象限對(duì)側(cè)池壁中點(diǎn)將大鼠放人水中，記錄2 min內(nèi)大鼠在原平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和游泳軌跡，計(jì)算大鼠跨躍平臺(tái)次數(shù)及各象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比。

2. 3評(píng)價(jià)指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)方法

定向航行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為逃避潛伏期、尋求次數(shù)。空間探索試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)大鼠原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分比(簡(jiǎn)稱原平臺(tái)象限比)、跨越原平臺(tái)次數(shù)。數(shù)據(jù)以Sl'SS 11. Sfor Window。統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組間差異采用重復(fù)測(cè)量多因素方差分析[3-4]及單因素方差分析，方差齊時(shí)用SNK法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Game，一Howell檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3. 1定位航行試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，模型組潛伏期Sd內(nèi)變化平緩，無(wú)明顯縮短，給藥治療的各組潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而明顯縮短。說(shuō)明模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶行為能力明顯受損，藥物對(duì)癡呆模型均有一定程度的保護(hù)作用。以SNK法進(jìn)一步對(duì)各組作兩兩比較，結(jié)果見(jiàn)表1.

由表1可見(jiàn)，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，與其他各組相比均具有顯著性差異(P<0.05)，各給藥組與青年組、老年組比較均有顯著性差異(P<0. 05 )。模型組與其他各組的尋求次數(shù)差異均具有顯著性(P < 0. 05 )。低劑量組、石杉?jí)A甲組、高劑量組、老年組、青年組尋求次數(shù)均值從小到大依次排列，且兩兩相鄰間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，不相鄰間各組兩兩比較均具有顯著性差異(P<0.05)03. 2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

由表2可見(jiàn)，組間兩兩比較(SNK法)結(jié)果顯示，跨平臺(tái)次數(shù)除模型組外其他各組兩兩間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而各組與模型組均有顯著性差異(P < 0. 05 )。原平臺(tái)象限比模型組較其他各組明顯偏小，差異顯著(P<0.05);給藥各組間及與老年組間兩兩無(wú)顯著差異(P>0.05)，而與青年組則均有顯著性差異(P < 0. 05)。

4討論

AD患者的臨床表現(xiàn)為智力減退、近期記憶缺失，以及相關(guān)行為能力障礙，因此觀察AD模型及藥物治療效果的重要指標(biāo)之一，就是對(duì)學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行直接客觀的評(píng)價(jià)。

MWM實(shí)驗(yàn)是英國(guó)心理學(xué)家Morri。于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并用于空間學(xué)習(xí)記憶的大腦機(jī)制研究領(lǐng)域[5]。就記憶屬性的不同分類系統(tǒng)來(lái)看，經(jīng)典MWM所檢測(cè)的是大鼠在多次的訓(xùn)練中形成的一種空間參考記憶，其儲(chǔ)存的機(jī)制主要涉及邊緣系統(tǒng)及大腦皮層有關(guān)腦區(qū)，屬于陳述性記憶[3]。臨床健忘或癡呆的患者，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出[6]。所以從檢測(cè)的記憶屬性來(lái)說(shuō)，運(yùn)用MWM系統(tǒng)進(jìn)行防治此類疾病有效藥物的篩選研究是較為恰當(dāng)?shù)摹?/font>MWM試驗(yàn)作為記憶量化的良好方法，其提供的參數(shù)眾多，定位航行試驗(yàn)歷時(shí)Sd，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)龐大且復(fù)雜，為準(zhǔn)確反映出各組數(shù)據(jù)間客觀存在的內(nèi)在聯(lián)系，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用胡鏡清等[3]推薦的重復(fù)測(cè)量多因素方差模型進(jìn)行分析處理。